简 介:
ZAPA3G DNA 聚合酶是一种新型的单酶体系,经基因工程改造和电子重构架,增加了DNA的亲和力,与其他高保真酶相比具有行业领先性。该酶具有 6kb/min 以上的扩增速度,扩增基因组或cDNA可达10kb,扩增质粒或噬菌体DNA可达20kb。ZAPA3G DNA 聚合酶具有高度的杂质耐受性、长片段扩增能力、高扩增成功率、高产量,这些特点使得ZAPA3G 系列产品可用于粗制样品的直接扩增,无需核酸纯化步骤。该酶经化学修饰,采用专有的热启动技术确保 50℃以下 100%无活性,因此可在室温建立反应体系。热启动配方中,酶是结合在一个特定载体上,使其在第一部变性之前一直保持灭活状态,只有 95 度条件下加热 5min 后才能完全恢复酶的活力,从而启动 PCR 扩增,这样就消除了反应设定和启动过程中非特异性启动导致的产物增加,提高 PCR 扩增的特异性、PCR 产物的产量、 准确性和精确性。该试剂盒独特的反应缓冲液,可在宽范围。中得到良好的扩增结果、检测灵敏度更高、信号更强。
Multiplex PCR 又称多重 PCR,是指在同一 PCR 反应体系里加上两对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的 PCR 反应,已被广泛应用于科学研究和疾病诊断等多个领域,特别适用于微量样本的多位点检测。本制品使用ZAPA三代 DNA 聚合酶和优化的多重 PCR 反应缓冲液,使其可有效扩增 20 重以上的 PCR,具有极高的灵敏度,最大程度上减少了反应体系优化步骤。
特点和用途:
(1) 高杂质耐受性:该酶可耐受植物中的多糖多酚;全血、血清、血浆中的肝素、高浓度的血红蛋白、甘油三脂、乙醇、胍盐、SDS 等强 PCR 抑制剂。
(2) 完全封闭的热启动特性,50℃以下 100%无活性。
(3) 优化的反应缓冲体系,避免非特异性扩增。
(4) 高灵敏度,有效扩增 0.1ng 的人基因组 DNA(20重)。
使用方法
1. 按下表配制反应体系并混合均匀:
2×ZAPA3G Multiplex PCR Mix | 25 μl |
10×Primer Mix | 5 μl |
*模板 DNA | 0.1~200 ng |
ddH2O | up to 50 μl |
*模板 DNA:人的基因组200 ng,质粒200 pg,cDNA 1-10μl。
2. PCR 扩增循环参数
循环数 | 温度 | 时间 |
预变性 | 95°C | 5 min |
30-35 Cycles | 95°C | 20 s |
57~60°C | 60 s |
72°C | 6 kb/min |
末延伸 | 72°C | 10 min |
请注意:该制品为热启动制品预变性步骤 5min 不可缩短,否则 DNA 聚合酶无法恢复活性。
3. 电泳:1kb 以内的扩增产物建议使用 3%~4% 琼脂糖凝胶,电压使用 80V,可以有效的分离各扩增片段。
4. 注意事项:
(1) 当模板 GC 含量>70%时,请添加 SupersmartTM 5×高GC含量模板、长片段辅助buffer(Cat. No.: ZS-M-1058)。
(2) 推荐引物设计原则:引物长度保持在 22 - 30 bp,扩增产物长度在 2kb 以下,GC 含量 50% - 60%,尽量减少各引物之间 TM 的差值。
(3) 检测单引物特异性:多重 PCR 反应前,应对设计的引物逐一扩增,以确定是否有非特异性扩增和扩增效率。
(4) 引物推荐浓度:推荐扩增片段300bp每条引物反应终浓度为 0.05-0.15μM,如某些目标片段产量偏低或偏高,适度调整其对应引物使用量以优化反应结果。
(5) 反应前需将引物制成 10×Primer Mix:
引物储存液 | 用量 | 10x 浓度 |
引物 1 F(100μM) | 1 μl | 1 μM |
引物 1 R(100μM) | 1 μl | 1 μM |
引物 2 F(100μM) | 0.5 μl | 0.5 μM |
引物 2 R(100μM) | 0.5 μl | 0.5 μM |
................... |
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引物 n F(100μM) | 3 μl | 3 μM |
引物 n R(100μM) | 3 μl | 3 μM |
ddH2O Upto | 100μl |
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常见问题及解答:
1. 扩增产物少或没有扩增。
(1) 降低退火温度(每个梯度降低 1℃)。
(2) 增加模板量。
(3) 增加 PCR 循环数。
(4) 增加退火时间为 90 sec,必要时可延长退火时间至 3 min。
(5) 增加引物使用量。
2. 存在非特异性扩增。
(1) 减少循环数,提高退火温度(每个梯度降低 1℃)。
(2) 减少引物使用量。
(3) 重新设计引物。
3. 电泳时条带模糊。
(1) 减少循环数(每次减少 3 个循环)。
(2) 减少起始模板量。
(3) 延长彻底延伸步骤时间至 15 - 30 min。
(4) 减少退火时间。
储存:
长期储存置于-20°C以下,可保存2年;短期使用置于 4°C,可保存3个月。
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