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简介:
pUC57 Simple 通用克隆载体采用了 TOPO 酶连接技术,载体预先偶联上 TOPO酶,当加入 PCR 扩增产物后,5 min 就可以完成连接反应,连接阳性率高。pUC57 Simple 通用克隆载体消除了大部分的常用酶切位点,便于后续亚克隆。该产品适用于 Taq 酶扩增的含“A”尾巴和高保真酶扩增的 PCR 产物的连接,载体含有氨苄青霉素抗性筛选标记。
(1)快速连接,最快仅需 5min;
(2)操作简单,仅需加入载体和片段即可;
(3)无需蓝白斑筛选,阳性率高;
(4)不包含任何酶切位点,便于后续亚克隆;
(5)平末端和 A 尾产物通用。
注意:引物不能磷酸化。
测序引物:
正向测序引物:M13F(-47): 5’- CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’;
反向测序引物:M13R(-48): 5’- AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’;
pUC57 Simple TA/平端通用克隆载体图谱
操作方法:
1. PCR 产物的纯化
1.1 PCR 扩增完毕后,电泳检测产物,如无非特异性扩增、无引物二聚体、条带单一明亮,则可采用 PCR 产物纯化试剂盒纯化后用于连接。产物不经纯化也可以进行连接,但效果稍差一些。
1.2 PCR 扩增完毕后,电泳检测产物,如有非特异性扩增条带或引物二聚体,则必须采用胶回收后用于连接。
1.3 PCR 扩增模板来源于 Amp抗性质粒,则必须采用胶回收后用于连接。
PCR 产物大小 | PCR 产物用量 | 载体用量 | 摩尔比 | 连接时间 | 阳性率 |
0.1~1kb | 2~10ng | 1 μl | 1: 5~10 | 5~10min | >95% |
1~3kb | 10~20ng | 1 μl | 1: 5~10 | 15~20min | >90% |
>3kb | 5ng/kb | 1 μl | 1: 5~10 | 30min | >85% |
3. 连接反应
向0.2 ml EP 管中依次加入如下试剂
成 分 | 用 量 |
PCR 产物 | 0.5~4 μl (用量参考上表) |
pUC57 Simple Vector | 1 μl |
加无菌水至总体积为 | 5 μl |
轻轻吹打混合均匀后,室温(25°C)孵育 5~30min,通常放置 10min。 |
关于 PCR 产物的用量说明:
在 PCR 产物回收后(在无法进行 NanoDrop 测定浓度的情况下),按照一般的经验可估算产物的用量,原则为:3 μl 回收产物在琼脂糖凝胶电泳后,可清晰判断的情况下,使用 0.5~1 μl 回收产物(约 5~15 ng)进行连 接即可。回收产物难以观察的情况下使用 4 μl 回收产物(约 5~10 ng)进行连接。使用过高量的 PCR 产物将会导致连接效 率低下,长斑数量和阳性率急剧下降。
4. 转化
4.1 取5-10 μl上一步骤的反应样品加入到50-100μl DH5α等感受态细胞中(注意所加入的DNA样品体积不要超过感受态体积的1/10),轻轻混匀,将该混合物置于冰上30 min。
4.2 42℃水浴中90秒进行热激,然后迅速放回冰浴中,静置3~5 min。
4.3 加入500 μl不含抗生素的SOC或LB培养液,轻轻混匀,37℃震荡培养1h。
4.4 将菌液5000 rpm离心1 min以沉淀菌体。吸去大部分培养液,剩余约50-100μl的培养液,重悬菌体。然后全部均匀涂布到含适当抗生素的LB平板上,37℃培养箱中培养过夜。
4.5 第二天挑取平板上的克隆进行菌落PCR或者提取质粒进行酶切鉴定,也可以挑取至少 3 个克隆进行测序验证。
5. PCR 菌检挑选阳性克隆菌落(连接产物条带单一、清晰情况下,阳性率>95%,可无需菌检,直接测序,本步骤可省略)
5.1 用 10 μl Tip 头挑取生长良好的单个菌斑,放置于 10 μl 无菌水中吹打几次混合均匀。
5.2 取 1 μl 上述菌液于 20 μl PCR 体系中,用 PCR 特异性引物或者 M13F(-47)和 M13R(-48)鉴定阳性克隆。
PCR 反应体系 | PCR 反应条件 | ||||
反应体系 | 用量 | 温度 | 时间 | ||
5XEffcient Taq PCR Master Mix (with Dye) | 4 μl | 变性 | 95°C | 30 s | |
M13F(-47) (10 μM) | 1 μl | 循环 25~30 | 95°C | 10 s | |
M13R(-48) (10 μM) | 1 μl | 58°C | 20 s | ||
菌液模板 | 1 μl | 72°C | 2kb/min | ||
灭菌双蒸水 | 13 μl | 72°C | 2 min |
5.3 以上述菌液为模板进行 PCR 扩增,并电泳检测(如载体自连接,则菌检 PCR 扩增长度为:140bp)。
6. 质粒提取及测序
将鉴定为阳性的菌液接种于 5ml LB 培养基中(含 100ug/ml 氨苄青霉素),37°C 振荡(225 rpm)培养过夜,提取质粒。并使用 M13F(-47)或 M13R(-48)进行测序。
常问题及分析:
1. 问题:平板克隆数少或不长斑
原因:通常是由于感受态效价较低造成,更换感受态可解决问题。平板为 100μg/ml 氨苄青霉素抗生素,检查是否用错。
2. 问题:阳性率低
原因:连接 PCR 产物有引物二聚体、连接产物条带不明亮(浓度不够)。
3. 问题:鉴定条带大小与预期不符
原因:PCR 产物在回收过程中发生断裂,造成小片段产物,在连接大片段时尤其严重。菌检产物大小为 140bp+目标产物 大小,如插入片段为 500bp,则菌检阳性克隆为 640bp。
4. 问题:提取的质粒是否能进行酶切鉴定
回答:该载体上不携带任何常规酶切位点,除非产物自带酶切位点,否则不能酶切鉴定。
储存:
-20℃可保存 2 年,-80℃可保存 5 年,避免反复冻融。
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