Supersmart 第五代高效耐热反转录酶(ZS-M14006)

简介：

第五代高效耐热反转录酶是在鼠源病毒反转录酶基础上进行定点突变改良而得。经过突变文库筛选，使得其热稳定性更强，可耐受 65℃高温反应，可以避免普通的M-MuLV反转录酶(RNase H-)在37℃反应时的一些不足。第五代高效耐热反转录酶具有灵敏度高、特异性高、合成能力高(较多的全长cDNA)，热稳定性好和半衰期长的特点。相比于低温条件下反转录反应，采用高温反转录可显著打开RNA二级结构，从而提高复杂RNA模板的扩增性能、提高反转录cDNA的长度和产量，从而提高后续检测的灵敏度。高温反转录对于高GC含量RNA的反转录，能有效减少二级结构，提升反转录效率。该酶去除了RNase H活性，不能够选择性剪切RNA和DNA杂合双链中的RNA，从而避免反转录过程中降解RNA。在通读GC含量高，二级结构复杂的RNA模板和反转录长片段cDNA等方面的表现突出。精心优化的反应 Buffer使逆转录酶应用范围更广，对后续的PCR以及定量PCR实验兼容性高。 合成的cDNA第一条链后续可以用于PCR、real-time PCR、cDNA第二条链的合成等。也可以用于DNA探针的标记，通过引物延伸来分析RNA，以及用于基因芯片荧光探针的标记。

单位定义：以poly(rA)为模板、oligo(dT)为引物，在 37°C条件下，10分钟内催化1 nmol 的dTTP掺入形成酸不溶性沉淀物所需要的酶量，定义为一个活性单位。

操作方法

1. 按以下组分配制反应体系

*注：Oligo dT(25)使用浓度为20~50μM,如使用Random9随机引物可使用125μM，基因特异性引物可使用5μM。

2．在 PCR仪上按下列条件进行反转录反应

30°C           5 min

*37~65°C   15~60 min

85°C           10 min

4°C             For ever

*通常反转录温度设置为 50°C，无论是高GC或长片段模板，均可获得综合性的 cDNA 产量。在采用 65°C 反应条件时可显著提高>75%GC含量 cDNA 产物。

3. 反转录所得的cDNA可直接用于PCR反应或储存于-20°C。

常见问题

1. 总RNA反转录产物电泳观察不到。

a. 反转录产物由于是从模板反转录而获得，而模板的量本身比较低，反转录的量通常还要少于模板量，并且总RNA的反转录产物大小很不均匀，因此通常总RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。

2. 反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。

a. PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增，看是否可以成功扩增。如果可以成功，则说明PCR扩增体系没有问题，此时通常是目的基因的引物设计欠佳，当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增，则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。

b. 模板RNA发生了降解。哺乳动物细胞或组织的总RNA琼脂糖电泳后应该可以看到清晰的18S和28S rRNA条带，并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例应该大于等于2.0。如果比例小于2.0，则提示总RNA发生了显著的降解，最好能重新制备总 RNA样品。避免RNA降解的主要方法是，严格进行RNA的相关操作，包括带洁净手套、戴一次性口罩、在洁净环境中抽提或制备RNA，以尽量避免RNase污染。

c. 模板RNA的纯度偏低。在提取纯化RNA的过程中，残留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA、胍盐、磷酸、焦磷 酸、多胺、亚精胺等会抑制反转录酶活性。对RNA样品进行柱纯化，或者进行沉淀、洗涤和再溶解，通常可以有效去除残留的污染物。通常选择使用中实Trizol抽提获得的总RNA完全可以满足反转录反应的需要。

d. 反转录反应的模板量不足。在抽提获得总RNA后，在进行一些精细的定量检测时通常会进行DNase I消化，以充分去除可能的残留的DNA的干扰。DNase I进行热失活时，需要加入EDTA至终浓度为2.5mM，否则RNA在没有螯合剂的情况下，在加热过程中容易被水解，从而导致模板量不足。此外，扩增特定基因时，需要先查询该基因的组织分布特点，利用其高表达的组织进行目的基因的反转录和克隆。用该基因丰度极低的组织或细胞样品进行反转录和PCR扩增，通常会由于模板量过少而PCR扩增失败。

e. 没有使用适当的反转录引物。对于细菌RNA和不含poly(A)尾巴的RNA，要用random hexamer引物代替Oligo(dT)18引物。 使用基因特异性反转录引物时，需要确保基因特异性引物设计合理正确。

f. 如果RNA模板富含GC或容易形成二级结构，此时可以考虑把反转录温度提高到45-55ºC。

储存：

-20°C可保存3年。

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批号 201022-BG10001 -001