简介:
RNA later是一种液态的,无毒的组织保存试剂。可以迅速渗入新鲜组织细胞的胞浆中,在非冻状态下原位稳定和保护细胞内的RNA。取下组织薄片后立刻浸入RNA later中保存,而不会引起RNA的降解,这样可以不必马上处理样品或将样品冷冻在液氮之中以备以后处理。RNA later可广泛应用于动物组织(心、肝、肾、肌肉、睾丸、脑、脾等)、培养细胞、RNA 病毒、果蝇、细菌、白细胞、全血、一些植物组织。溶液难以渗透的组织(蜡质植物组织,骨骼等)除外。
RNA later与多种RNA提取试剂兼容(TRI Reagent 、TRI LS)。也可直接用于组织切片,免疫学和流式细胞分析。
注意事项:
如果使用时发现有沉淀或者析出,可以在37℃加热重新溶解后使用,不影响产品质量。
操作方法:
RNA later只用于新鲜组织,浸泡RNA later前禁止冷冻组织。只需简单切碎组织样品,任何一边的最大厚度不能大于0.5 cm,然后将组织碎块放入到5 倍体积的RNA later 中保存。
1. 动物组织
RNA later不会溶解或破坏组织样品的结构。因此浸泡在其中达到渗透平衡
的组织可以从RNA later中取出,切成更小的块,然后放回到RNA later中以便
下次使用。小鼠肝、肾和脾等小器官可以完整的存放在RNA later中。
2. 植物组织
多数植物组织直接浸泡入RNA later即可,少数具有自然屏障防止扩散的植物如蜡表皮的叶组织,需要先破坏其屏障,以便于RNA later渗透进入组织。
3. 组织培养细胞
细胞吹打下来后,离心收集细胞,弃上清,用冰浴的PBS缓冲液洗涤细胞一次去除残留培养液。再用少量的PBS 重悬细胞,然后加入5-10倍体积RNA later,混匀。
4. 血和血浆
从红细胞和血清中分离出来白细胞可按照组织培养细胞处理,保存。
抗凝全血,血清和血浆:全血加入3倍体积RNA later,混匀。
5. 酵母
离心收集3x108的细胞(>12000× g离心2分钟),立刻将细胞团重悬在0.5-1ml的 RNA later中。酵母细胞可以保存在RNA later中25℃ 8小时或4℃ 1周。如需长期保存,将酵母细胞在RNA later中放置一个小时后,离心收集细胞(>12000× g离心5分钟),弃上清,将酵母细胞团放入液氮瞬时冷冻后放置于-80℃储存。
6. 细菌
RNA later是抑菌的,但储存在RNA later中的细菌细胞仍保持其完整性,E.coli 在RNA later中4℃保存一个月,可提出完整的RNA。
RNA later中样本的保存:
请勿在RNA later溶液中立即冷冻样品;储存在4℃过夜(使溶液彻底穿透组织),去除上清,然后移至-20℃或-80℃长期保存。
-80℃保存
用于样品长期保存。将样本放置于4℃孵育过夜,然后从溶液中取出样本,保存于-80℃。对于组织培养细胞,则无需去除RNA later,直接冷冻于-80℃。样品使用时可在室温解冻及再冻存。
-20℃保存
将样本放置于4℃孵育过夜,然后转移到-20℃。样品使用时可在室温解冻及再冻存。( -20℃条件下,样品不会被冻结,但是可能会形成一些结晶,这些结晶并不影响RNA提取)
4℃保存
样本可以在4℃存放一个月。
25℃保存
将样品放在尽可能冷的环境中。如果周围温度超过25℃,应尽可能使RNA later中的样品冰浴数小时。存放于25℃样本的RNA在一周内保持完整,保存两周的样品RNA有轻微降解;存放于37℃样本的RNA在24小时内保持完整,3天时有部分降解。
RNA later保存样本的RNA提取:
1.组织
用消毒镊子将样本从RNA later中取出,用吸水纸稍稍吸去残留的RNA later
后,浸泡在RNA 提取溶液中。迅速匀浆,提取RNA。
2.细胞
(1)去除RNA later后提取RNA
存放于RNA later中的细胞,可以承受较高的离心速度而不被裂解。但由于每种细胞的强度不一样,可以先做预试验,以保证在使用的速度下高心不会破坏细胞。(HeLa 细胞大约需要3000×g,)或在离心前加等体积的PBS稀释RNA later和细胞的混合物,以减少溶液的密度,使细胞溶液可以沉淀下来。
注意:RNA later 的浓度比典型的细胞培养介质的浓度高,因此用通常沉淀活细胞的离心力无法沉淀RNA later 中的细胞。
(2)不去除RNA later,直接提取RNA
直接加10倍体积的一步法提取试剂(如TRI reagent)到细胞和 RNA later的混合物,然后按照正常步骤操作。
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