Superbrilliant® 第四代高效耐热MuLV反转录酶（ZS-M14005）

简介：

第四代超高效耐热MuLV反转录酶是在鼠源病毒反转录酶基础上进行定点突变改良而得。经过突变文库筛选，使得其热稳定性更强，可耐受 55℃高温反应，可以避免普通的M-MuLV反转录酶(RNase H-)在37℃反应时的一些不足。相比于低温条件下反转录反应，采用高温反转录可显著打开RNA二级结构，从而提高复杂RNA模板的扩增性能、提高反转录cDNA的长度和产量，从而提高后续检测的灵敏度。具有灵敏度高、特异性高、合成能力高(较多的全长cDNA)，热稳定性好和半衰期长的特点。高温反转录对于高GC含量RNA的反转录，能有效减少二级结构，提升反转录效率。该酶去除了RNase H活性，不能够选择性剪切RNA和DNA杂合双链中的RNA，从而避免反转录过程中降解RNA。在通读GC含量高，二级结构复杂的RNA模板和反转录长片段cDNA等方面的表现突出。精心优化的反应 Buffer使逆转录酶应用范围更广，对后续的PCR以及定量PCR实验兼容性高。

用途：

该酶合成的cDNA第一条链后续可以用于PCR、real-time PCR、cDNA第二条链的合成等。也可以用于DNA探针的标记，通过引物延伸来分析RNA，以及用于基因芯片荧光探针的标记。

单位定义：以poly(rA)为模板、oligo(dT)为引物，在 37°C条件下，10分钟内催化1 nmol 的dTTP掺入形成酸不溶性沉淀物所需要的酶量，定义为一个活性单位。

操作方法:

1. 按以下组分配制反应体系

*注：Oligo dT(25)使用浓度为20~50μM,如使用Random9随机引物可使用

125 μM，基因特异性引物可使用5μM。

2．在 PCR仪上按下列条件进行反转录反应

30°C   15 min

55°C   30~60 min

85°C   10 min

4°C    For ever

3. 反转录所得的cDNA可直接用于PCR反应或储存于-20°C。

常见问题:

总RNA反转录产物电泳观察不到。

a. 反转录产物由于是从模板反转录而获得，而模板的量本身比较低，反转录的量通常还要少于模板量，并且总RNA的反转录产物大小很不均匀，因此通常总RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。

2. 反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。

a. PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增，看是否可以成功扩增。如果可以成功，则说明PCR扩增体系没有问题，此时通常是目的基因的引物设计欠佳，当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增，则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。

b. 模板RNA发生了降解。哺乳动物细胞或组织的总RNA琼脂糖电泳后应该可以看到清晰的18S和28S rRNA条带，并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例应该大于等于2.0。如果比例小于2.0，则提示总RNA发生了显著的降解，最好能重新制备总 RNA样品。避免RNA降解的主要方法是，严格进行RNA的相关操作，包括带洁净手套、戴一次性口罩、在洁净环境中抽提或制备RNA，以尽量避免RNase污染。

c. 模板RNA的纯度偏低。在提取纯化RNA的过程中，残留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA、胍盐、磷酸、焦磷 酸、多胺、亚精胺等会抑制反转录酶活性。对RNA样品进行柱纯化，或者进行沉淀、洗涤和再溶解，通常可以有效去除残留的污染物。通常选择使用中实Trizol抽提获得的总RNA完全可以满足反转录反应的需要。

d. 反转录反应的模板量不足。在抽提获得总RNA后，在进行一些精细的定量检测时通常会进行DNase I消化，以充分去除可能的残留的DNA的干扰。DNase I进行热失活时，需要加入EDTA至终浓度为2.5mM，否则RNA在没有螯合剂的情况下，在加热过程中容易被水解，从而导致模板量不足。此外，扩增特定基因时，需要先查询该基因的组织分布特点，利用其高表达的组织进行目的基因的反转录和克隆。用该基因丰度极低的组织或细胞样品进行反转录和PCR扩增，通常会由于模板量过少而PCR扩增失败。

e. 没有使用适当的反转录引物。对于细菌RNA和不含poly(A)尾巴的RNA，要用random hexamer引物代替Oligo(dT)18引物。 使用基因特异性反转录引物时，需要确保基因特异性引物设计合理正确。

f. 如果RNA模板富含GC或容易形成二级结构，此时可以考虑把反转录温度提高到45-55oC。

      中实同创                                                           Q公司

β-actin                                                      

 mcp                    

Fig 1. Superbrilliant^®  TRIZOL裂解液提取的小鼠心肌细胞HL-1的RNA，中实基因反转录酶与其他品牌反转录酶比较，使用Superbrilliant^®   2×SYBR Green qPCR Master Mix对基因β-actin和MCP进行qPCR检测。

储存：

-20°C可保存3年。

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批号 BC31005 -001