Superbrilliant® 多糖多酚/复杂植物 RNA 快速提取试剂盒(ZS-M11020)

简介：

 本公司在无苯酚、氯仿RNA快速提取技术基础上，又独家研发成功基因组DNA清除柱技术可以有效清除gDNA残留，得到的RNA不需要DNase消化，可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。本试剂盒可从植物组织，特别是富含多糖多酚的植物组织中快速提取总RNA，可同时处理大量不同样品。独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，离心沉淀去除多糖多酚和次级代谢产物，裂解混合物用乙醇调节RNA结合吸附到基因组DNA清除柱，RNA被选择性洗脱过滤，吸附在基因组DNA清除柱上的DNA无法洗脱连同柱子一起丢弃去除DNA。RNA用乙醇调节结合条件后，在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过快速的漂洗-离心的步骤，将细胞代谢物，蛋白等杂质去除。低盐的RNase Free H2O可将RNA从硅基质膜上洗脱下来。

注意事项：

1.所有的离心步骤均可在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C或者类似离心机。

2.需要自备β-巯基乙醇，乙醇，研钵(可选)。

3.样品处理量不要超过DNA清除柱和RNA吸附柱的处理能力。开始摸索实验条件时，可使用较少的样品处理量，根据试验情况增加或者减少样品处理量。

4.Solution PR1和Solution PR2和Solution PR3中含有刺激性化合物，操作时戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

5.关于DNA的微量残留:一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留（DNase I消化也无法做到100%无残留），本公司的RNA提取产品，采取了本公司独特的缓冲体系和DNA清除柱技术，绝大多数DNA已经被清除，不需要DNase I消化，可直接用于反转录PCR和荧光定量PCR。个别特殊情况如DNA含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：

a.选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接区，DNA就不能作为模板参与扩增反应。

b.选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。

c .将RNA提取物用RNase Free的DNase I处理。

d.在Solution PR3漂洗前，直接在RNase Free吸附柱上进行DNase I柱上消化处理。

操作方法：（实验前请先阅读注意事项）

前期准备：取1ml Solution PR1于离心管内(如果Solution PR1有析出或者沉淀需先置于65℃水浴直至溶液澄清），在Solution PR1中加入β-巯基乙醇（1ml Solution PR1加50μl β-巯基乙醇）。颠倒混匀后65℃水浴中预热。多个样品则按照比例放大准备。

1.直接研磨法（实验室无液氮情况下或者柔软易研磨植物样品推荐此法）:

a.新鲜植物组织或者冰冻保存样品称重后取100mg-200mg（水分少的样品如叶片种子等可加100mg-150mg，水分多的样品如草莓西瓜果实可多加一些）迅速剪成小块放入研钵，加入1ml Solution PR1（已加有β-巯基乙醇）室温下充分研磨成匀浆，注意应该迅速研磨让组织和Solution PR1立刻充分接触以抑制RNA酶活性。(β-巯基乙醇是Solution PR1的关键成分，必要的时候可以提高终浓度到10-20%。如果特别复杂植物，可以尝试在裂解液中加入PVP40至终浓度为2%。)

b.将裂解物转入离心管，立即剧烈振荡15秒，放回65°C水浴中5-10min，期间颠倒1-2次帮助裂解。13000rpm离心10分钟。

c.取上清到一个新1.5ml离心管。加入上清体积一半的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响实验，应立即吹打混匀。取上清时表面有漂浮物，用吸头挑开吸取下面清澈液体即可。

d.立刻进行操作步骤的步骤3。

2.液氮研磨法（适用广泛，提取复杂难破碎，易降解样品时推荐此法）:

a.液氮中研磨新鲜或-70°C冷冻的材料至细粉。

b.转移100mg-200mg细粉（水分少的样品如叶片种子等可加100mg-150mg，水分多的样品如草莓西瓜果实可多加一些）到Solution PR1（已加有β-巯基乙醇）离心管中。立即剧烈涡旋30-60秒或者用吸头吹打混匀裂解，降低粘稠度和提高产量。

c.放回65°C水浴中（5-10min），中间偶尔颠倒1-2次帮助裂解。

d.将裂解物13,000rpm离心10分钟。

e.取上清转到一个新1.5ml离心管。加入上清体积一半的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀。取上清时表面有漂浮物，用吸头挑开吸取下面清澈液体即可。

f.立刻进行操作步骤的步骤3。

3.将混合物(每次小于720μl，可以多次加入)加入DNA清除柱中，清除柱放入收集管中，13,000rpm离心2分钟，弃掉废液。确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。

4.将基因组DNA清除柱子放在一个干净2ml离心管内（不需RNase Free或者DEPC处理，一般干净的新离心管即可。），在DNA清除柱内加500μl Solution PR2，13,000rpm离心30秒，收集滤液（RNA在滤液中），加入0.5倍体积的无水乙醇(通常为450-500μl左右)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀。

5.立刻将混合物(每次小于720μl，可以分多次加入)加入一个RNase Free吸附柱中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm离心2分钟，弃掉废液。确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。

6.加700μl Solution PR3，室温放置1分钟，13,000rpm离心30秒，弃掉废液。

7.加入500μl Washing Buffer RW，13,000rpm离心30秒，弃掉废液。重复一次。

8.将RNase Free吸附柱放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。

9.取出RNase Free吸附柱，放入一个RNase Free离心管中，在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase Free H2O（事先70-90℃预热可提高产量），室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟。

10.要提高RNA产量，可再加30-50μl RNase Free H2O重复步骤9，合并两次洗液，或者将第一次的洗脱液加回到吸附柱重复洗脱一遍。洗脱两遍的RNA浓度高,分两次洗脱合并RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,用户可根据需要选择。

储存：

 1. 储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。

2. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH 值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

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