Supersmart CCK8细胞增殖与毒性检测试剂盒 (ZS-C31002)

简介：

Cell Counting Kit-8 (CCK-8)试剂盒是一种基于WST-8而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度检测的试剂盒。该试剂盒通过采用水溶性四唑盐WST-8 [2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐]实现快速检测，其原理是WST-8在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成橙黄色的甲臜染料（formazan）。通过比色，可以动态地量化活细胞的数量，从而对细胞增殖或药物毒性进行检测。

该试剂盒利用水溶性四唑盐 WST-8 [2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-Methoxy PMS 存在的情况下能够被还原成水溶性的甲臜染料，生成的甲臜量与活细胞数量成正比。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。WST-8对细胞无明显毒性。加入CCK-8溶液显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，使检测时间更加灵活，便于找到最佳测定时间。

应用：

细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测。

操作方法：

A. 细胞计数测定

1. 96孔培养板中贴壁或悬浮细胞100 μl /孔培养体积(>2000个细胞/孔)。

2. 向每孔加入10 μl的CCK- 8溶液 (注意不要在孔中生成气泡，它们会影响O.D.值的读数)。如果起始的培养体积为200 μl，则需加入20μl CCK-8溶液。

注：加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液，但没有加入细胞的孔作为空白对照。

3. 将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

4. 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

5. 如果暂时不测定O.D.值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10 μl 1% w/v SDS溶液或者 0.1 M HCl溶液，并遮盖培养板避光保存。在24小时内吸光度不会发生变化。

B.细胞增殖实验和细胞毒性检测

1. 96孔培养板中贴壁或悬浮细胞100 μl /孔培养体积(>5000 个细胞/孔)。

2. 向培养板加入10 μl不同浓度的待测药物。

3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间 (例如: 6、12,、24或48 小时)。

4. 向每孔加入10 μl CCK-8溶液 (注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 O.D 值的读数)。

5. 将培养板在培养箱内孵育1-4 小时。

6. 用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。

7. 如果暂时不测定O.D.值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10 μl 1% w/v SDS溶液或者0.1 M HCl溶液，并遮盖培养板避光保存。在24小时内吸光度不会发生变化。

C.制作标准曲线 (需要测定细胞绝对数量时)

1. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。

2. 按比例 (例如：1/2 比例) 依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。

3. 接种后培养使细胞贴壁，然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定O.D.值，制作出一条以细胞数量为X轴，O.D.值为Y轴的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量 (使用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致)。

实例：

1.接种96孔板293T细胞，每孔加入10 μl CCK-8溶液，混合均匀，在37℃，5% CO2培养箱中培养，酶标仪读取不同培养时间的OD值，做标准曲线。 

2.接种96孔板MDA-MB-231细胞，每孔加入10 μl CCK-8溶液，混合均匀，在37℃，5% CO2培养箱中培养4h，酶标仪读取450 nm处OD值，做标准曲线。 

注意事项：

1. 接种时注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接种几个孔就混匀一下。培养板周围一圈孔培养基容易挥发，为了减少误差，建议培养板的四边每孔只加培养基或PBS，而不作为指标检测孔。

2. 本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，如果待检测体系中存在较多的还原剂，例如一些抗氧化剂会干扰检测，需设法去除。

3. 用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。

4. 培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异。一般情况下，白细胞较难染色，因此需要较长的培养时间或增加细胞数量 (~10⁵个细胞/孔)。悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于悬浮细胞，在培养 1- 4 小时后，可先从培养箱中取出，目察染色程度或用酶标仪测定决定。若染色困难，可将培养板放回培养箱，继续培养数小时后再确定。染色的最佳时间可定为悬浮细胞的最佳培养时间。对于贴壁细胞，培养时间一般为 1- 4 小时，但在培养30分钟左右即可取出肉眼观察染色程度 (根据细胞种类而定，需要摸索一下条件)。

5. 若细胞培养时间较长，培养基颜色发生变化或pH发生变化，建议更换新鲜的培养基后再加CCK-8 试剂。

6.检测依赖于脱氢酶催化的反应，所以还原剂(例如一些抗氧化剂)会干扰检测，如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。

储存：

-20℃避光可保存 2 年，融化后 4℃避光放置可保存1年。反复解冻和冷冻会增加背景值。

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