Supersmart Annexin V/PI双染细胞凋亡检测试剂盒 (ZS-C31001)

简介：

细胞凋亡（Apoptosis）是由基因控制的细胞自主的有序性死亡，又称为程序性细胞死亡（Programmed Cell Death），在机体发育、组织稳定等方面起着十分重要的作用。Annexin V/PI双染法是根据凋亡细胞出现细胞膜的不对称性丧失，即磷脂酰丝氨酸（Phosphatidyl serine，PS）由膜内向膜外翻转原理所建立。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使 PS 暴露在细胞膜外。Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性，对 PS 有高度的亲和性。能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸PS高亲和力特异性结合。Annexin V 是检测早期细胞凋亡的最灵敏指标之一，以标记了FITC的Annexin V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 Propidium iodide（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期和死细胞由于细胞膜破裂，因此 PI 能够将细胞核染红。将AnnexinV与PI匹配使用，若横坐标表示Annexin V信号，纵坐标表示PI信号，则左下象限 (Annexin V-/PI-) 代表活细胞；右下象限(Annexin V+ /PI-) 代表早期凋亡细胞；右上象限(Annexin V+ /PI+)代表凋亡晚期细胞和坏死细胞；左上象限(Annexin V-/PI+) 被认为是许可范围内的检测误差。

本试剂盒使用改进型的高纯度FITC染料，其在红色通道（690nm）无发射光，因此极大的减少了对红色通道的干扰。使用该试剂盒进行细胞凋亡检测时荧光相互干扰更小、检测更准确。

操作步骤： 

1. 贴壁细胞：用胰酶消化至单细胞悬液； 悬浮细胞：可直接使用。

2. 1000 rpm（400g），离心 5 min，弃上清。

3. 加入 1 ml PBS，轻轻吹打使细胞悬浮，1000rpm，离心5 min，弃上清。

4. 再重复步骤 3 一次，尽可能吸除多余的PBS溶液；

5. 加入 1× Annexin V Binding Buffer 重悬细胞，使细胞密度为 0.2-1×10⁶个/ml。

注意：a.必须使用 1× Annexin V Binding Buffer 重悬细胞（不可使用 PBS 重悬，否则会导致Annexin V 无法结合PS位点）；

b.将细胞悬液用200 目筛网过滤一次，再进行下述操作将有助于获得最佳试验结果。

6. 取100 μl上述细胞重悬液，加入 5 μl Annexin V-FITC、5 μl PI Staining Solution混合均匀，室温避光放置15 min。

7. 反应结束后加400 μl Binding Buffer轻轻混匀在1小时内上流式细胞仪检测。

注意：a. 流式细胞仪要求配备488 nm激发光源；FITC使用绿色通道检测（525 nm）；PI推荐使用红色通道检测（690 nm）， PI也可使用黄色通道检测（580 nm），但黄色通道必须进行荧光补偿操作。

b. 本试剂采用高纯度改进型 FITC染料，其无法在红色通道检测，因此采用绿色通道和红色通道进行检测时，通常无需荧光补偿操作。

8. 若用荧光显微镜检测，将细胞混合液离心，取细胞沉淀涂片，再进行观察。 

Fig 1.处理好的乳腺癌MDA-MB-231细胞用Annexin V和PI (各5µl)在室温下避光染色15 min，再进行BD流式细胞分析，通过Flow Jo分析数据。

注意事项：

1. 整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。

2. 反应完毕后请尽快检测，反应1小时后荧光强度就开始衰变。

3. Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物质，在操作时请注意避光。

4. 试验操作过程中佩戴手套等防护用品。

5. 试验开始前将一定量的10× Annexin V Binding Buffer用超纯水（1：9）稀释至1×备用。

6.注意避免反复冻融

7.如果有细菌或真菌污染，会严重影响检测效果。

8.如果细胞收集过程中使用了胰酶，需注意设法去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解Annexin V-FITC，导致染色失败。

9.用于流式细胞仪检测时，如果发现Annexin V-FITC单独染色时出现了过多的PI假阳性细胞，并且通过调整相关设置和参数也 无法改善，可以用PBS将Annexin V-FITC稀释3-10倍后再进行检测，这样通常可以有效减少假阳性的坏死细胞。

储存：

2-8℃，有效期1年。

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