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简介
miRNA mimic是miRNA 模拟物化学合成的成熟miRNA双链,即用型。
miRNA inhibitor是miRNA抑制物化学修饰的成熟mi RNA互补单链,即用型。
miRNA agomir是特殊化学修饰的miRNA激动剂适用于细胞、动物实验,即用型。
miRNA ant agomir 是特殊化学修饰的miRNA拮抗剂适用于细胞、动物实验,即用型。
运输保存
产品以冻干粉的形式,常温运输。收到产品后,请于-20℃~-80℃保存,冻干粉可以稳定保存一年。使用前瞬时离心,用RNase-free H2O或灭菌ddH2O,配制成20μM储存液,分装保存,避免反复冻融 (不超过5次)。
表1 20 μM储存液的配置
注:如需进行高内涵筛选试验,可进行miRNA library。
使用前须知
产品以冻干粉的形式提供,由于影响结晶形态的因素很多,产品外观有些差异,甚至形态无法用肉眼可见。此为正常现象。
为避免外界因素(包括酶,极端pH或者温度条件等)导致产品降解,所有操作请严格遵循RNA操作规则。实验过程中,产品最好于冰上放置,使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。
细胞实验方法:
为了降低细胞密度、试剂用量,转染效率等因素导致的孔间差异,保证实验的可靠性和可重复性,一般建议:
1)转染实验中每个转染样品至少设置3个复孔;
2)接种细胞时,每孔接种的细胞数量尽量保持一致,且细胞在各孔的表面平均分布。
1.转染浓度
miRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。中实同创推荐的miRNA mimic初始浓度为50nM,miRNA inhibitor浓度为100nM,客户可根据实验具体情况优化转染浓度,优化的范围建议为10~200nM。
注:miRNA inhibitor往往需要用到较大的用量才能观察到较好的抑制效果,相当于miRNA mimic的几倍用量,这可能与miRNA inhibitor竞争性抑制的作用机制及作用效率有关。因此,当使用推荐的转染浓度没有获得预期效果时,可适当选择更高的浓度或选择antagomir进行实验。
2.转染方法
以Reagent转染miRNA mimic于24孔板,转染浓度为50nM为例,其他规格容器的试剂用量请参考表2,若使用其它转染试剂,请参考对应转染试剂说明书。
1)接种细胞
a. 贴壁细胞:以Hela细胞为例,接种1×105~5×105个细胞至含有适量完全培养基的24孔板培养孔中,使转染时的细胞密度能够达到30~50%。
b. 悬浮细胞:以THP1细胞为例,接种1×105~5×105个细胞至含有适量完全培养基的24孔板培养孔中。
注:1)不同细胞生长速度不同,接种数量及密度需依据细胞类型,培养时间,实验目的而且2每孔接种的细胞数量应尽量相同,使细胞均匀分布。
2)转染
对于每个转染样品,请按以下步骤准备:
稀释mimic:用30μl 1×Buffer稀释1.25μl 20μM miRNA mimic轻轻混匀。
b. 混合液制备:加入3μl Reagent,轻轻吹打混匀,室温孵育0~15min。
注:1)请勿振荡,溶液可能会有浑浊,但不会影响转染;2)混合液可室温放置一段时间,但不宜超过24h。
c. 将混合液加入到无双抗完全培养基中,轻轻混匀。
注:混合液加入至原细胞培养基,一般无需移除或更换,但需依据客户具体实验情况而定。
d. 或者进行其他必要的特殊处理(如加药处理)。
e. 将培养板置于37℃的CO2培养箱中培养24~96h(培养时间与实验目的相关)。
表2 转染miRNA mimic用量参考
注:实验参考用量示例 对于部分细胞类型需要进一步优化
3. 效果检测
miRNA mimic/inhibitor作用效果往往通过功能方面检测,转染完成后24~72小时均可进行检测,最佳检测时间与细胞类型及研究的miRNA有关。以下为几种常用的miRNA效果检测方法:
a. 使用qRT-PCR,基因芯片,新一代测序等方法检测靶基因mRNA转录水平,甚至全基因表达谱是否发生变化。
注:miRNA可能通过抑制翻译的机制直接影响靶基因的蛋白表达水平,mimic/inhibitor对靶基因表达的影响往往需要进一步验证。
b. 使用Western Blot,蛋白芯片等方法检测靶基因的蛋白水平是否发生相应改变。
c. 检测细胞功能(细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移等)是否发生相应变化。
d. 研究miRNA mimic对靶基因的影响可以以验证有效的siRNA作为阳性对照。
e. 通过与miRNA靶基因双荧光素酶报告载体(中实基因可提供构建服务)共转来验证miRNA mimic/inhibitor
动物实验方法
miRNA动物实验的体内环境复杂实验周期长对miRNA产品的稳定性提出了更高的要求。
miRNA动物实验方法主要分为两类,细胞移植和直接给药。中实同创推荐采用稳定性更好、可靠性更高的化学修饰agomir和antagomir进行动物实验,具体方案需要依据实验目的及条件而定,具体用量请参考表3 。
常见问题:
1.如何检测miRNA mimic、inhibitor、agomir、antagomir的使用效果?对目的miRNA进行qPCR检测可以吗?
使用mimic后可以采用qPCR对miRNA进行过表达验证,但inhibitor不适用。因为从工作原理上讲,inhibitor是与miRNA发生结合从而抑制了miRNA发挥作用,它并非改变了miRNA的生成。其效果检测可通过检测靶基因的蛋白表达水平,或者通过萤光素酶报告系统。Agomir与antagomir由于增加了化学修饰,可能会对qRT-PCR造成一定的影响,可能通过qPCR方法验证使用效果。agomir可以通过Northern Blot检测miRNA表达,antagomir可以通过检测miRNA的靶基因表达来验证其使用效果。
2.Mimic与inhibitor、agomir与antagomir的阴性对照(NC)是否可以通用?一定要使用NC 吗?
不能通用,因为mimic/agomir是双链RNA,inhibitor/antagomir是单链RNA。建议要使用NC作为对照组,以排除可能因为应激而产生的假阳性结果。
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