是什么影响了PCR结果？

是什么？抑制了PCR反应！

一个PCR反应过程分为很多的步骤，同时也受到很多因素的影响，可以分为内部因素和外部因素，内部因素是指正常试剂体系中的成分，外部因素是指环境或者样本带入的因素。

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 临床PCR常见问题 

  1   假阳性问题 

方法学问题：靶基因序列特异性、引物错配、非特异性扩增

污染问题：样本污染、产物污染

解决办法：严格区分试验区域及人员培训，使用UNG技术

  2   假阴性问题 

问题来源：试剂因素、操作因素、仪器因素、标本因素

解决办法：

(1) 设置阳性对照监测试剂问题

(2) 降低操作难度，提高操作人员水平

(3) 室内质控、室间质控监控

(4) 使用抗干扰能力强的试剂提取样本

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 体系内部因素 

1. 引物：引物是整个PCR体系最重要的部分，也是决定一个PCR反应特异性的关键，引物在设计时要遵守一定的原则（长度、扩增跨度、碱基等）。

2. 酶及其浓度：目前有两种Taq DNA聚合酶，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠杆菌合成的基因工程酶，酶浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

3. dNTP的质量与浓度：dNTP溶液呈酸性，一般配置成体系需将其调节至7.0-7.5，正常情况下4种dNTP的浓度应该相等，如果其中某一种过高就会引起错配，浓度过低又会引起PCR产物的产量。

4. 模板核酸（靶标）：模板核酸的量和纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，对于RNA模板更要注意RNA的降解。

5. Mg2+浓度：主要影响PCR扩增的特异性和产量，一般要对应dNTP的浓度。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异性扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

6. 温度与时间的设置：PCR原理三步骤涉及变性-退火-延伸三个温度点，也就是变性温度与时间、退火（复性）温度与时间、延伸温度与时间。

7. 循环次数：循环次数决定PCR扩增程度，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般温度循环次数在30-40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量就越多。

 体系外部因素 

除上述抑制剂外，还存在一定的PCR增强剂，比如甜菜碱、二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、PEG、亚精胺和单链DNA结合蛋白等，但是在高浓度情况下，也会对PCR产生抑制，因此如何采用增强剂消除抑制剂的影响，采用多少的浓度对结果都存在很大的影响。

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相信细心的朋友已经发现，应对PCR抑制难题最重要是解决体系内部因素的聚合酶质量和核酸模板的纯度问题，尤其外部环境或者样本带入的各种抑制剂更是一个关键点。而中实基因在免提取直扩PCR扩增方面的前沿产品——第三代ZAPA DNA聚合酶，它帮助处于PCR实验困境的科研实验员们解决了PCR反应抑制的关键症结点，并由此“对症下药”，采取了优化的快速PCR扩增方案。帮助实验室的各位老师在繁忙中的科研生活中多一丝轻松容易，腾出更多宝贵时间对研究进行深入的思考。

在免提取直扩PCR扩增领域，中实基因多种多样、简便易用的高保真&直接扩增PCR解决方案，能够满足科研实验员们日常PCR实验的独特需求：(1)样品直接扩增：耐乙醇、胍盐、肝素、血清、植物多酚等杂质，直接扩增粗制核酸样本，省去核酸提取步骤；(2)快速扩增性能：具有6kb/min的扩增能力，95 度加热5min后才能恢复酶的活力；(3)高保真度扩增：保真性能约为Taq DNA聚合酶的60~280倍。为高通量PCR实验提供全面、整合的解决方案。

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在一个又一个实验室发生的真实故事中，我们都遇到过各种PCR扩增不出条带，特异性不好，拖带不清晰，PCR结果总是不尽如人意。近年来针对PCR反应中各种抑制性杂质这一特定问题，中实基因资深专家秉承着“立足生命科学、助力科研工作”的使命十余年潜心研发以优化核酸酶性能，第三代ZAPA DNA聚合酶的成功研发克服了PCR样本带入杂质产生的的各种影响，我们据此量身定制了一系列免提取直接PCR扩增解决方案，涵盖PCR直扩试剂盒、高保真PCR预混液、qPCR直扩试剂等，致力于提供全面的分子实验解决方案，为临床与生命科学市场服务。

免杂质打扰，从样本直接到“结果”

PCR直扩试剂

第三代ZAPA DNA聚合酶的研发，克服了样本带入杂质对PCR反应的影响，中实基因免提取直接PCR扩增解决方案，贯穿覆盖各种gDNA和cDNA直扩流程，全方位助力院校和临床医学分子实验。

(1) Supersmart^TM 第三代2×ZAPA全能PCR预混液(with dye)---血液等液体样品可6kb/min直接扩增，耐杂质能力强，保真性能约为Taq酶的60倍。

(2) Superbrilliant^TM 第三代ZAPA动物组织/植物直扩PCR试剂盒---动植物直接扩增，配合DNA快速释放剂效果更好。

(3) Supersmart^TM 第三代2×ZAPA多重PCR预混液(with dye)---20对引物同一体系扩增，热启动扩增，耐杂质能力强。

(4) Supersmart^TM 2×ZAPA超保真PCR预混液(with dye)---保真性能约为Taq酶的280倍，耐杂质。

(5) Supersmart^TM 5×高GC含量&长片段辅助buffer---解决非特异性条带严重PCR， 高GC(>70%)，长片段(>4kb)。

超高保真，“飞”一样的感觉

高保真PCR预混液

通常，保真度表示为与 Taq DNA 聚合酶保真度的相对值。天然存在的校正DNA聚合酶（如 Pfu 和KOD）的保真度约为 Taq聚合酶的10倍，如何减少PCR过程中的错误复制，一直是分子生物家追求改革的目标。中实基因研发的Z5/Z6超保真DNA聚合酶来源于Pfu和KOD，经基因工程改造后，使具有100倍于Taq DNA聚合酶的保真能力，5-8kb/min的延伸速度。

(1) Supersmart^TM Z6热启动超保真PCR 预混液 (5×,with Dye)--- PCR效率更高，同时兼顾保真度，普通Taq酶60倍。

(2) Supersmart^TM Z5热启动超保真PCR 预混液 (5×,with Dye)---PCR更准，其保真度是普通Taq酶100倍。

(3) Supersmart^TM 超纯dNTP混合溶液---HPLC纯化纯度达到99.9%，不含DNase和RNase，可与所有的聚合酶配套使用。

立足经典，化繁为简

qPCR直扩/常规试剂

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）耗时短、初学者容易操作、实时监测生物体转录水平，是广大师生和科研工作者喜闻乐见、最广泛的分子实验之一。中实基因不断探索和创新多样化的qPCR直扩试剂，克服样本带入杂质对qPCR反应的影响，同时也擅长常规经典方法，提供基于不同实验样品和需求的解决方案。

(1) Supersmart^TM 2×粗样本SYBR Green qPCR预混液---热启动，细胞组织等可6kb/min直接扩增，耐杂质能力强。  

(2) Supersmart^TM 2×TaqMan探针法粗样本直接qPCR预混液---杂质高耐受性，探针法使用各种gDNA和cDNA。

(3) Supersmart^TM 第三代2×ZAPA多重探针qPCR预混液---最高的杂质耐受性，可进行4重以上的定量PCR检测。

(4) Supersmart^TM 5×快速SYBR Green qPCR预混液---聚合酶55℃以下没有任何活性，性能稳定。

中实基因致力于为生命科学领域客户提供便捷，稳定，全方位的解决方案。我们拥有独立的细胞培养、分子生物学和免疫学实验平台。以坚实的技术力量和实验平台为后盾，积极实践“中正信诚，唯真求实”的理念。

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