Superbrilliant® 高效组织/细胞miRNA提取试剂盒 (ZS-M15005)

1.对miRNA进行加A反应           2.反转录获得miRNA的cDNA产物            3.利用TaqMan探针进行qPCR检测

简介：

该试剂盒操作步骤简单、重复性好、miRNA产率高。该试剂盒中的裂解液是经过长时间研发改良的，具有一般裂解液不具有的裂解能力和提取灵敏度，试剂盒中的吸附柱采用特殊的硅基质膜填料，大大增强了其对RNA的吸附能力，尤其是small RNA（<200nt）。使用该试剂盒提取的小RNA（Small RNA）中，长度在 15-200nt 范围的RNA在95%以上，基本不含有大 RNA 和 DNA。本产品通过一步上柱即可获得高纯度的miRNA，可在45 min内完成小 RNA 的提取。该试剂盒广泛适用于动物组织、细胞和多糖多酚含量不高的植物组织样本。 经本制品提取的 Small RNA 纯度高，可以除去大部分28S和18S大片段RNA、蛋白质及基因组DNA。大幅度提高产物的纯度和产量，操作简便，兼容性强。

用途：

提取的RNA没有DNA和蛋白污染，可应用于后续分子杂交, 实时定量PCR和miRNA芯片等分子生物学实验。

操作方法：

样本使用量及小 RNA 产量

1. 组织样本提取

(1) 向1.5ml EP 管中加入300μl miRNA裂解液A。植物组织则再加入10μl β-巯基乙醇，混合均匀。

(2) 在液氮条件下充分将组织研磨粉碎，将一定的样品量（见样本使用量表）研磨成粉状的组织加入到上述 300μl miRNA裂解液A中，立即剧烈震荡至组织粉末彻底溶解于裂解液中。室温静置 5min 以充分裂解细胞。

注意：将组织加入到miRNA裂解液A后要迅速将组织震散，否则易引起组织成团状，不容易裂解。如发生成团状，务必用移液器将团状组织吹打松散。

(3) 向上述裂解完毕的裂解液中加入 350μl miRNA吸附液B，上下颠倒混合均匀。13,000 rpm 离心 5min，吸取 550μl上清液，转移到新的1.5 ml EP 管中。

(4) 向上述溶液中加入200μl无水乙醇，用力震荡数次，室温放置 5 min。

(5) 13,000 rpm 离心 10 min，转移700μl上清液到新的1.5 ml EP管中。

(6) 向上述溶液中加入300μl异丙醇，手腕用力上下颠倒数次。

(7) 分两次将上述溶液倒入到 miRNA 吸附柱中，13,000 rpm离心1 min，倒掉过滤液。

(8) 向吸附柱中加入700μl 75%异丙醇洗涤一次，13,000 rpm离心1 min，倒掉过滤液。

(9) 向吸附柱中加入 500μl 无水乙醇洗涤一次，13,000 rpm离心1 min，倒掉过滤液。

(10) 吸附柱13,000 rpm空离心2 min，去掉残留的乙醇。

(11) 将吸附柱放入到新1.5ml EP管中，室温放置 2 min，使残留乙醇挥发。在吸附柱滤芯上加入30μl Rnase free TE Buffer，室温静置 2min，13,000rpm 离心 2min，洗脱产物即为提取的miRNA。通常取1-2 μl该产物，即可使用Superbrilliant^TM miRNA反转录试剂盒（TaqMan法）进行反转录（货号：ZS-M15004）。

2. 细胞样本提取

(1) 贴壁细胞：胰酶消化细胞后，离心收集细胞沉淀。用100μl 1×PBS 重悬细胞后，加入 300μl miRNA裂解液A颠倒混合均匀，室温放置 5 min。

(2) 悬浮细胞：直接离心后，收集细胞沉淀。用100μl 1×PBS 重悬细胞后，加入300μl miRNA裂解液A颠倒混合均匀，室温放置 5 min。

(3) 向上述裂解完毕的裂解液中加入 250μl miRNA吸附液B，上下颠倒混合均匀。13,000 rpm 离心 5 min，吸取 550 μl上清液，转移到新的 1.5 ml EP 管中。

注意：加入细胞体积数与 miRNA吸附液B 总体积数为350μl。如加入 50μl细胞，则 miRNA吸附液B使用300 μl。

(4) 向上述 550μl 上清溶液中加入 200μl 无水乙醇，用力震荡数次，室温放置 5 min。

(5) 13,000 rpm 离心 10 min，转移 700μl 上清液到新的 1.5 ml EP 管中。

(6) 向上述溶液中加入300μl异丙醇，用力上下颠倒数次。

(7) 分两次将上述溶液倒入到 miRNA 吸附柱中，13,000 rpm离心1 min，倒掉过滤液。

(8) 向吸附柱中加入700μl 75%异丙醇洗涤一次，13,000 rpm离心1 min，倒掉过滤液。

(9) 向吸附柱中加入 500μl 无水乙醇洗涤一次，13,000 rpm离心 1 min，倒掉过滤液。

(10) 吸附柱13,000 rpm 空离心2 min，去掉残留的乙醇。

(11) 将吸附柱放入到新1.5 ml EP 管中，室温放置 2 min，使残留乙醇挥发。在吸附柱滤芯上加入30μl Rnase free TE Buffer，室温静置2 min，13,000 rpm 离心 2 min，洗脱产物即为提取的miRNA。通常取1-2 μl该产物，即可使用Superbrilliant^TM miRNA反转录试剂盒（TaqMan法）进行反转录（货号：ZS-M15004）。

Fig 1. 使用该试剂盒提取的MDA-MB-231细胞RNA，反转录后进行miR-21基因的qPCR

常见问题汇总：

(1) 本方法提取的小RNA，95％以上为小 RNA（<200nt），有时会残留一些>200nt 的 RNA，通常残留的>200nt RNA不影响后续试验操作。

(2) 本试剂盒提取的小RNA由于不含mRNA等大分子量的RNA，因此更适合做后续反转录试验，从而进行定量试验。

(3) 使用本试剂盒提取的miRNA浓度通常在50ng/μl左右，取5～10μl即可用于电泳检测。取1~2μl 即可用于Superbrilliant^®  miRNA反转录试剂盒（TaqMan法）进行反转录反应（货号：ZS-M15004）。

使用防护建议：

miRNA裂解液A 溶液中含有胍盐，其具有强烈的腐蚀性，试验时请务必佩戴防护眼镜、手套、口罩等防护措施，如有皮肤接触请立即用大量清水冲洗，再及时就诊。

自备试剂：

异丙醇、乙醇、75%异丙醇、植物组织需另备β-巯基乙醇。

储存：

室温可保存2年。 

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