简介:
Superbrilliant® Calcein AM /PI细胞双染试剂盒内含两种染料:钙黄绿素-AM(Calcein-AM)和碘化丙啶(Propidium Iodide,PI),分别对活细胞和死细胞染色。这个试剂盒可在荧光显微镜下同时观察在同一个细胞培养皿中的活细胞和死细胞。Calcein-AM 的乙酸甲基酯亲脂性很高,可透过细胞膜,通过活细胞内的酯酶作用脱去AM基团,产生的Calcein(钙黄绿素)发出强绿色荧光,因此活细胞在荧光显微镜下可被检测到绿色荧光(激发: 490 nm,发射: 515 nm)。另一方面作为核染色染料的PI可以通过受损的细胞膜进入到死细胞内并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光,因此死细胞会被检测到红色荧光(激发: 535 nm,发射: 617 nm)。除了用荧光显微镜外,也有报道可以用流式细胞仪和荧光酶标仪来进行定量检测。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发,因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545 nm激发,仅可观察到死细胞。
应用:
对活细胞和死细胞的染色检测。
操作方法:
用荧光显微镜观察细胞形态,由于不同细胞系的种类、浓度不同,最佳的染色条件不同,建议个别细胞摸索不同条件下的细胞贴壁情况,并确定Calcein-AM和PI的最佳浓度条件。
1. 染色溶液的配制
1) 将 Calcein-AM 储备液和 PI 储备液恢复至室温;
2) 分别加 2.5 µl Calcein-AM 原液和 12.5 µl PI 原液至 5 mL PBS(pH=7.4)中配制成染色工作液。Calcein-AM 的终浓度为 2 µmol/L,PI 的终浓度约为 5 µmol/L。
2. 细胞染色
1) 染色HeLa细胞等贴壁细胞时,使用Trypsin-EDTA等消化细胞,制备成细胞悬液。
2) 将细胞悬液离心3分钟 (1,000 rpm)。
3) 去除上清液,加入PBS缓冲液,细胞数量调整至105-106个/ml。再用移液器充分混匀。
4) 由于培养基中的血清等含有酯酶,Calcein-AM遇水会分解,会导致空白上升,所以需要离心数次,用PBS洗涤数次直到完全洗净。
5) 将200 µl细胞悬液移至小试管中,加入100 µl染色溶液,在37℃下孵育15分钟。
6) 在盖玻片上滴加适量的染色的细胞溶液。
7) 在荧光显微镜下,先用490±10 nm波长激发,观察黄绿色的活细胞,还可以同时观察到红色的死细胞,然后用545 nm波长激发,能够看到红色的死细胞。
3. 染色试剂的最佳浓度
Calcein-AM和PI最佳浓度根据不同的细胞种类而定,通过以下的操作,可以找到不同细胞染色试剂的最佳浓度。
1) 通过在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黄皂苷中孵育10分钟或通过在70%乙醇中孵育30分钟制备死细胞。
2) 用0.1-10 µM PI溶液对死细胞染色,以便找到仅对细胞核染色而不对细胞质染色的PI浓度。
3) 用0.1-10 µM Calcein-AM溶液对死细胞染色,以便找到不对细胞质染色的Calcein-AM浓度。接着用该浓度的Calcein-AM对活细胞染色以检验活细胞是否被染色。
储存:
4˚C 避光,可保存12个月。
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